PCR技術(shù)之父-凱利·穆利斯

部分友友還是搞不清楚PCR是個(gè)什么東西，搞不清楚為什么可以進(jìn)行基因擴(kuò)增，這一節(jié)我們就了解一下穆利斯與PCR技術(shù)的發(fā)現(xiàn)與發(fā)展。

一、PCR的提出和發(fā)展

      1983年春天的一個(gè)周五晚上，穆利斯開車帶著女友前往鄉(xiāng)間度周末。在蜿蜒的鄉(xiāng)間公路上開著車，一段DNA反復(fù)復(fù)制的景像，在他的腦海里冒了出來。

      事實(shí)上，DNA復(fù)制起始于DNA的解鏈，只需要通過加熱讓雙鏈DNA變?yōu)閱捂淒NA，然后再添加和單鏈DNA末端相結(jié)合的引物DNA，這樣就開始了復(fù)制的過程，因此，只需要人為的給予其一些條件，就可以讓DNA在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下由1個(gè)變?yōu)?個(gè)、2個(gè)變?yōu)?個(gè)……從而大量地復(fù)制擴(kuò)增!這些關(guān)于PCR雛形的想法讓穆利斯興奮不已，整個(gè)周末，山間小屋的全部紙片都被他用來打草稿了。

      1983年8月，穆利斯第一次正式地將他所設(shè)想的PCR方法原理在公司里作了展示，但是穆利斯的設(shè)想并沒有得到大家的認(rèn)同。

      經(jīng)過幾個(gè)技術(shù)員和穆利斯反反復(fù)復(fù)地調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件，直到1984年11月，他們第一次獲得了可信的結(jié)果，接下來，日裔技術(shù)員才木的加入使得PCR的結(jié)果更加干凈漂亮，毋庸置疑!

      1986年5月舉行的“人類分子生物學(xué)"專題研討會(huì)，在這次大會(huì)中，穆利斯在很多分子生物學(xué)界專家面前第一次報(bào)道了PCR的原理和實(shí)際應(yīng)用結(jié)果，向世人建立了其PCR發(fā)明人的印象。

      1988年，塞凱等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌中提取到了一種耐熱DNA聚合酶，將該來源的聚合酶用在PCR之后的結(jié)果讓大家欣喜若狂，此酶不僅耐高溫，熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶，并且大大地提高了擴(kuò)增片段的特異性和效率，靈敏度也大大提高。此酶被命名為TaqDNA多聚酶。這也就是現(xiàn)在PCR技術(shù)所常使用的酶。

      直到后來自動(dòng)熱循環(huán)儀的發(fā)明，實(shí)現(xiàn)了PCR的快速擴(kuò)增、自動(dòng)化，才使得PCR廣泛地應(yīng)用起來 。

二、什么是PCR？

     1.PCR，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)，一種體外擴(kuò)增核酸的技術(shù)。它可以在短時(shí)間內(nèi)倍增極微量DNA(理論上說僅有一個(gè)DNA就足夠了)至十萬或百萬倍。

     2.PCR過程主要分為以下三個(gè)階段：

      （１）變性（Denaturation）：將雙鏈DNA加熱至高溫（通常94-98℃），使其解鏈成為單鏈DNA。（高溫使DNA雙鏈變成單鏈）

模板DNA經(jīng)加熱至9５℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙徒DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備。

（２）退火（Annealing）：降低溫度（通常50-65℃），使寡核苷酸引物與目標(biāo)DNA片段的互補(bǔ)序列結(jié)合。引物的設(shè)計(jì)需要與目標(biāo)DNA片段的兩端互補(bǔ)，以確保擴(kuò)增的準(zhǔn)確性。（低溫使引物與模板結(jié)合）

１.DNA測序：PCR擴(kuò)增可以提供足夠的DNA量進(jìn)行測序，從而幫助人們了解DNA序列的結(jié)構(gòu)和功能。

２.基因分型：PCR擴(kuò)增可以擴(kuò)增出目標(biāo)基因的特定片段，從而進(jìn)行基因分型和分析。

３.基因克隆：PCR擴(kuò)增可以擴(kuò)增出目標(biāo)基因的全長或部分序列，從而進(jìn)行基因克隆和表達(dá)。

４.病原體檢測：PCR擴(kuò)增可以擴(kuò)增出病原體DNA的特異性序列，從而進(jìn)行病原體檢測和診斷。

[2] 張婷婷, 細(xì)說PCR——生物技術(shù)海洋之一粟, 生命世界. 2007

[３]許林玉, 凱利穆利斯, 科學(xué)人物. 2019

[4]古佳玉、安成才, T-Linker PCR技術(shù), 科學(xué)前言. 2003

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